海洋细菌MicrobacteriumesteraromaticumMCDA02产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化（一） 几丁质化学结构稳定

几丁质是海洋在自然界中含量仅次于纤维素的天然生物大分子，主要存在于海洋无脊椎动物、细菌酰酶昆虫的丁质壳及真菌的细胞壁。几丁质化学结构稳定，脱乙条件溶解性差，发酵导致应用受限。优化几丁质脱去一定程度的海洋乙酰基得到壳聚糖。壳聚糖含有大量的细菌酰酶游离氨基和碱性阳离子，溶解性提高，丁质生物相容性好，脱乙条件应用广泛，发酵导致全球市场上壳聚糖供不应求。优化

目前，海洋壳聚糖的细菌酰酶制备方法有化学法和生物法。化学法利用浓碱热解处理几丁质，丁质使其脱去其中的乙酰基，是工业上广泛使用的方法。但是，化学法产物品质不受控制，并会引起严重的环境污染问题。生物法，反应条件温和，催化过程易控，而且解决了化学法造成的环境污染问题，极具应用潜力。但生物法尚未工业大规模利用，原因是其方法应用的瓶颈问题是几丁质对聚合度较高的脱乙酰酶(Chitindeacetylase，CDA)活性不高。

目前报道的几丁质脱乙酰酶多产于真菌。真菌几丁质脱乙酰酶对真菌的营养、真菌细胞壁的合成和完整、芽孢的形成等起到关键作用，但是发酵水平较低，难以应用。细菌产几丁质脱乙酰酶报道较少，且报道的菌株中大部分分泌的几丁质脱乙酰酶只催化寡聚几丁质脱乙酰。海洋微生物丰富多样，本研究从海洋样品中筛选几丁质脱乙酰酶产生菌，对菌株进行鉴定，对发酵条件进行优化，为该菌株的进一步应用奠定基础。

一、材料与方法

1、材料与仪器

样品来源：海泥样品采集于连云港高公岛码头；富集培养基：几丁质2.5g／L、K₂HP0₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g／L，陈海水配置，pH7.0；平板筛选培养基：几丁质2g／L、K₂EHPO₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g/L、对硝基乙酰苯胺0.2g／L、琼脂20g／L，陈海水配置，pH7.0；种子培养基：蛋白胨5g／L、酵母粉lg／L，陈海水配置，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨lOg／L、ZnSO₄0.5g／L、木薯淀粉11g／L，陈海水配置，pH7.9。
SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；分光光度计：杭州明基科学仪器有限公司；SPX-250B-2生化培养箱：上海博迅实业有限公司；DK-8D电热恒温水槽：上海-恒科技有限公司；Nikon90i全电动显微镜：上海普赫光电科技有限公司。

2、实验方法

（1）产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选

初筛：称取lg泥样，加入富集培养基，在30℃、180r／min培养72h。取富集培养液100uL均匀涂布于筛选培养基，30℃、培养3～5d，挑取周围出现明显黄色圈的菌落，在LB培养基中进一步划线纯化并保存。

复筛：将初筛得到的菌株分别接到种子液中，30℃、180r／min摇床培养24h，再以1％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，30℃、180r／min摇床培养72h，取上清为粗酶液并进行酶活力测定和催化α-几丁质脱乙酰的测定。选取酶活力较高，并能催化几丁质脱乙酰的菌株进行进一步研究。

酶活性和催化α-几丁质脱乙酰的测定按照报道的方法进行。酶活单位(U)定义：在上述反应条件下每小时产生对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

（2）菌株MCDA02的鉴定

根据伯杰氏细菌手册对MCDA02进行形态学及生理生化鉴定。用Axygen试剂盒提取MCDA02的基因组DNA作为PCR扩增模板，16SrDNA通用引物采用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反应体系为：PCRmix(12.5μL)，上下游引物(各lgL)，DNA模板(2μL)，水(9.5μL)。反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃终延伸10min。PCR产物送至南京思普金公司测序。序列测定后，提交GenBank数据库并进行BLAST比较分析，利用MEGA7软件进行同源性分析，构建系统发育树。

（3）单因素优化菌株MCDA02发酵产CDA培养基

在原发酵培养基的基础上，保证接种量l％、30℃、装液量20％、180r／min发酵72h的发酵条件不变，改变培养基中的碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉，氮源：蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米浆(干粉)、米糠、花生粕、麸皮、NaN0₃、NH₄C1、(NH₄)₂S0₄，无机盐：MgS0₄、CuS0₄、CaCl₂、NaH₂P0₄、KH₂P0₄、MnS0₄、ZnS0₄、BaCl₂、FeCl₃，分别取样测定酶活力，确定最佳碳源、氮源及无机盐。

（4）单因素优化菌株MCDA02发酵产CDA发酵条件

确定最佳发酵培养基后，将种子液以l％接种量接种至发酵培养基，30℃、装液量20％、180r／min发酵96h，每隔12h取样测酶活力，确定最佳发酵时间；将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，装液量20％、180r／min，在不同温度下培养72h，取样测定酶活力，确定最佳发酵温度；将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，30℃、装液量20％、180r／min，调节发酵培养基不同初始pH，培养72h后测定酶活力，确定最佳培养基起始pH；将种子液以1％接种量接种至不同装液量发酵培养基，30V、180r／min，培养72h后测定酶活力，确定最佳装液量；将种子液以不同接种量接种至装液量为20％的发酵培养基，30℃、180r／min，培养72h后测定酶活力，确定最佳接种量。

（5）响应面优化菌株MCDA02发酵产CDA发酵条件

根据单因素实验结果，选取对产酶影响最显著的三个变量为因变量，进行三因素三水平响应面实验设计，优化发酵条件。

3、数据处理与分析

每组试验设置3组平行，重复试验3次，试验结果用平均值±标准方差(n=3)表示，采用Origin2018作图，响应面采用DesignExpert10进行统计分析。

二、结果与分析

1、几丁质脱乙酰酶产生菌的筛选

通过变色圈法总共筛选得到了3株有变色圈的菌株，将这些菌株进行划线分离纯化，保存于斜面培养基中，置于4℃冰箱保存。将初筛得到的菌株接入种子培养液中，30℃摇床培养24h后，以1％的接种量接入发酵培养基，30℃培养72h，分别测定其酶活力。选取酶活力最高的作为实验菌株，即为MCDA02。

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